Сибирь хотой (Leonurus sibiricus L.) ургамлын хандны тирозиназа дарангуйлах идэвхийн судалгаа

Хураангуй

Үндэслэл: Тирозиназа нь меланогенезийн эхний болон хурд хязгаарлагч шатанд оролцож, L-тирозиныг L-DOPA болгон гидроксилжуулах, L-DOPA-г допахинон болгон исэлдүүлэх урвалыг катализладаг зэс агуулсан фермент юм. Тирозиназын идэвхийг бууруулах байгалийн гаралтай нэгдлүүдийг илрүүлэх нь эм зүй, фармакогноз, гоо сайхны бүтээгдэхүүний судалгаанд ач холбогдолтой. Leonurus төрлийн ургамлууд фенолт нэгдэл, фенилпропаноид, флавоноид, иридоид, алкалоид болон дитерпеноид зэрэг олон төрлийн хоёрдогч метаболит агуулдаг бөгөөд зарим Leonurus зүйлээс ялгасан нэгдлүүдийн тирозиназа дарангуйлах үйлдэл өмнө нь мэдээлэгдсэн. Гэвч Сибирь хотой (Leonurus sibiricus L.) ургамлын центрифугийн хуваарилалтын хроматографиар ялгасан фракцуудын тирозиназа дарангуйлах идэвхийн талаарх мэдээлэл хязгаарлагдмал байна. Зорилго: L. sibiricus ургамлын бутанолын фракцыг центрифугийн хуваарилалтын хроматографийн аргаар фракцлан, нимгэн үеийн хроматографийн профайлд үндэслэн нэгтгэсэн дээжүүдийн mushroom tyrosinase дарангуйлах идэвхийг үнэлж, хамгийн идэвхтэй фракцын бүлгийг тогтоох. Арга, аргачлал: L. sibiricus-ийн бутанолын фракцыг центрифугийн хуваарилалтын хроматографийн системээр ялгаж нийт 82 фракц цуглуулав. Фракцуудыг нимгэн үеийн хроматографийн аргаар silica gel хавтан дээр этилацетатметанол (85:15, v/v) хөдөлгөөнт фаз ашиглан хөгжүүлж, NPG илрүүлэгч урвалжаар боловсруулан хэт ягаан туяаны гэрэлд ажиглав. Ижил төстэй толбоны байрлал, тоо болон флуоресценцийн профайлтай дараалсан фракцуудыг нэгтгэж нийт 15 нэгтгэсэн дээж бэлтгэв. Центрифугийн хуваарилалтын хроматографийн 59-64-р фракцууд ижил төстэй TLC профайл үзүүлсэн тул дээж 11 болгон нэгтгэсэн. Тирозиназа дарангуйлах идэвхийг mushroom tyrosinase болон L-DOPA субстрат ашигласан 96-нүхт микроплейтийн спектрофотометрийн аргаар тодорхойлов. Дээжүүдийг DMSO-д 1 мг/мл концентрациар бэлтгэж, 100 мМ фосфатын буфер (pH 6.8), 20 мкл дээж, 20 мкл mushroom tyrosinase (500 ОУН/ мл)-ийг 10 минут урьдчилан инкубацалсны дараа 80 мкл 8 мМ L-DOPA нэмж 25°C-д 20 минут урвал явуулав. Допахромын үүсэлтийг Promega GloMax Explorer microplate reader-ээр 450 нм-д хэмжив. Дээжийн өөрийн шингээлтийг background хэмжилтээр засварлаж, кожик хүчил (1 мг/мл)-ийг эерэг хяналтаар ашиглав. Үр дүн: Нэгтгэсэн 15 дээжийн тирозиназа дарангуйлах идэвх харилцан адилгүй байв. Центрифугийн хуваарилалтын хроматографийн 59-64-р фракцуудыг агуулсан дээж 11 хамгийн өндөр идэвх үзүүлж, тирозиназын идэвхийг 35.89% дарангуйлав. Дараагийн өндөр идэвхийг дээж 14 (21.98%), дээж 5 (20.43%), дээж 3 (16.96%) үзүүлсэн бол бусад дээжийн дарангуйлалт 0-11.73%-ийн хооронд байв. Эерэг хяналт кожик хүчил ижил нөхцөлд 59.14% дарангуйлалт үзүүлсэн. Дээж 11-ийн идэвх бусад нэгтгэсэн дээжээс өндөр байсан нь биологийн идэвхтэй нэг буюу хэд хэдэн бүрэлдэхүүн центрифугийн хуваарилалтын хроматографийн 59–64-р фракцын мужид харьцангуй баяжсан байж болохыг таамаглаж байна. Дүгнэлт: Центрифугийн хуваарилалтын хроматографийн фракцлалт, TLC-д суурилсан фракцуудын нэгтгэл болон mushroom tyrosinase-L-DOPA скринингийг хослуулснаар L. sibiricus-ийн бутанолын фракцаас тирозиназа дарангуйлах идэвх харьцангуй өндөртэй бүлгийг тогтоох боломжтой байв. Центрифугийн хуваарилалтын хроматографийн 59-64-р фракцуудыг нэгтгэсэн дээж 11 нь цаашид LC-MS/MS шинжилгээ, биоидэвхэд чиглэсэн дахин фракцлалт, нэгдэл тусгаарлалт болон концентрацихамааралт IC5050 судалгаанд тэргүүлэх дээж болох боломжтой.